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浅谈PCR反应体系构建设计中的重要要素--引物

点击次数:137次  发布时间:2020-11-11
  PCR具有突出的优势,如特异性,灵敏度,高产率,快速,简便,可重复性好,易于自动化。它可以在试管中分析待研究的靶基因,或者可以在几个小时内将某个基因片段扩增到十万甚至一百万次,使肉眼可以直接观察判断。从头发,一滴血甚至是细胞中提取的DNA都可以扩增出足够数量的DNA用于分析研究和测试鉴定。PCR技术是生物医学领域的一项革命性举措和里程碑。因此,PCR反应体系构建是非常必要的。
  PCR反应的五个要素:参与PCR反应的五种主要物质,即引物,酶,dNTP,模板和Mg2+。引物是在PCR反应体系构建特定反应的关键。PCR产物的特异性取决于引物和模板DNA之间的互补程度。从理论上讲,只要您知道任何模板DNA序列,就可以设计一条互补的寡核苷酸链作为引物,并使用PCR在体外大量扩增模板DNA。
 

PCR反应体系构建

  PCR反应体系构建设计中引物应遵循什么原则?
  1、引物长度:15-30bp,通常在20bp左右;
  2、引物扩增范围:200-500bp为宜,具体条件可扩增大10kb的片段;
  3、引物碱基:40%-60%的G+C含量合适,G+C太少,扩增效果差,G+C太容易出现非特异性条带。ATGC是随机分布的,避免了5种以上的电子核苷酸啸叫或字符串排列;
  4、避免引物的二级结构,避免两个引物之间的互补,尤其是3'末端互补,否则会形成引物二聚体以产生非特异性扩增条带;
  5、引物3'末端的碱基,尤其是后一个和倒数第二个碱基,应严格配对,以避免末端碱基的碱基错配导致PCR失败。
  6、引物具有或可以加入合适的限制位点。扩增的靶序列应具有合适的限制位点。这适合进行限制性分析或分子克隆非常有益;
  7、引物的特异性:引物应与核酸序列数据库中的其他序列没有明显的同源性。
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