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PCR反应体系构建中引物的设计原则

点击次数:48  发布时间:2020-11-16
   引物是PCR反应体系构建的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上任何一段模板DWA序列,就能按其设计互补的寡桉苷酸链做引物,利用PR就可将模板DWA在体外大量扩增。

PCR反应体系构建

  PCR反应体系构建中引物的设计原则:
  1、引物长度:15-30bp ,常用为20bp左右;
  2、引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段;
  3、避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,不然会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条帯;
  4、引物碱基:G+C含量以40-60M为宜,G+C 太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGc一般随机分布,避免5个以上的嘌呤或咤啶核苷酸的成串排列;
  5、引物3端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败;
  6、引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列一般有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很友好;
  7、引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量以每条引物0.1-1umol或10-100pmo1,以较低引物量产生所需要的结果为准,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
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