PCR反应体系构建中引物的设计原则
点击次数：1039 更新时间：2020-11-16
引物是PCR反应体系构建的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上任何一段模板DWA序列,就能按其设计互补的寡桉苷酸链做引物,利用PR就可将模板DWA在体外扩增。
PCR反应体系构建中引物的设计原则：
1、引物长度:15-30bp ，常用为20bp左右；
2、引物扩增跨度:以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段；
3、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补,特别是3'端的互补，不然会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条帯；
4、引物碱基:G+C含量以40-60M为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGc一般随机分布，避免5个以上的嘌呤或咤啶核苷酸的成串排列；
5、引物3端的碱基,特别是末及倒数第二个碱基,应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；
6、引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列一般有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很友好；
7、引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量以每条引物0.1-1umol或10-100pmo1,以较低引物量产生所需要的结果为准，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
