建立PCR反应体系时需注意的几个问题

　　建立PCR反应体系时需注意的几个问题

　　首先要说的是Taq酶，其特征是5`→3`DNA聚合酶活性，缺乏5`→3`核酸外切酶活性，在70-75摄氏度时活性较高。在典型的聚合酶链反应中，当总反应体积为100微升时，需要约2.5微升Taq酶。需要注意的是，使用的酶量太高，不会引起非特异性扩增，而当酶量太低时，合成产物的量会减少。

　　第二要注意的是dNTP的质量和浓度。脱氧核糖核酸的质量和浓度与聚合酶链反应扩增效率密切相关。在PCR反应中，dNTP一般应为50 ~ 200 umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量，dNTP可以与Mg2结合降低游离Mg2的浓度。四种dNTP的浓度应该相等(如摩尔制剂)，如果其中任何一种不同于其他种类(高或低)，就会造成不匹配；dNTP保存不当，使其不稳定，不活跃。少量包装，在-20摄氏度冷冻。反复冻融会降解dNTPdNTP溶液呈酸性，应配制成高浓度，然后用1M  NaOH或1M  Tris-HCl缓冲液调节pH值至7.0 ~ 7.5。

　　第三、模板的数量。在一般的聚合酶链反应扩增中，104到107个模板分子可以获得满意的结果。

　　第四、Mg2浓度，一般PCR反应中，当各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2

　　浓度一般为1.5 ~ 2.0 mmol/L，Mg2浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增。浓度过低，Taq  DNA聚合酶活性降低，反应产物减少。

　　后，引物是聚合酶链反应特异性反应的关键，聚合酶链反应产物的特异性取决于导入

　　DNA与模板的互补程度。为了保持尹武，的完整性，应避免反复冻融。

　　当然要特别注意加入的水，一个是ph，一个是纯度。