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建立PCR反应体系时需注意的几个问题

点击次数:85  发布时间:2020-11-09
   PCR链式反应,也称聚合酶链式反应,是一种体外酶促合成特定DNA片段的方法。它由几个反应组成,如高温变性、低温退火和在合适温度下延伸,这些反应在循环,进行,以便能够快速扩增目标DNA。它具有特异性强、灵敏度高、操作简单、省时的特点。
  建立PCR反应体系时需注意的几个问题
  首先要说的是Taq酶,其特征是5`→3`DNA聚合酶活性,缺乏5`→3`核酸外切酶活性,在70-75摄氏度时活性较高。在典型的聚合酶链反应中,当总反应体积为100微升时,需要约2.5微升Taq酶。需要注意的是,使用的酶量太高,不会引起非特异性扩增,而当酶量太低时,合成产物的量会减少。
  第二要注意的是dNTP的质量和浓度。脱氧核糖核酸的质量和浓度与聚合酶链反应扩增效率密切相关。在PCR反应中,dNTP一般应为50 ~ 200 umol/L,浓度过低会降低PCR产物的产量,dNTP可以与Mg2结合降低游离Mg2的浓度。四种dNTP的浓度应该相等(如摩尔制剂),如果其中任何一种不同于其他种类(高或低),就会造成不匹配;dNTP保存不当,使其不稳定,不活跃。少量包装,在-20摄氏度冷冻。反复冻融会降解dNTPdNTP溶液呈酸性,应配制成高浓度,然后用1M  NaOH或1M  Tris-HCl缓冲液调节pH值至7.0 ~ 7.5。
  第三、模板的数量。在一般的聚合酶链反应扩增中,104到107个模板分子可以获得满意的结果。
  第四、Mg2浓度,一般PCR反应中,当各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2
  浓度一般为1.5 ~ 2.0 mmol/L,Mg2浓度过高,反应特异性降低,出现非特异性扩增。浓度过低,Taq  DNA聚合酶活性降低,反应产物减少。
  后,引物是聚合酶链反应特异性反应的关键,聚合酶链反应产物的特异性取决于导入
  DNA与模板的互补程度。为了保持尹武,的完整性,应避免反复冻融。
  当然要特别注意加入的水,一个是ph,一个是纯度。
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