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PCR反应体系构建引物应遵循的原则

点击次数:409次  发布时间:2020-10-26
  PCR(Polymerase Chain Reaction)反应体系是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。具有易自动化\特异、敏感、产率高、简便、快速、重复性好等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA的片段于在数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;或者可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中,扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去需要几天甚至几星期才能做到的事情,用PCR技术只需在几小时以内便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
  PCR反应体系构建中引物是特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核昔酸链作引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

PCR反应体系构建

  PCR反应体系构建引物应遵循的原则:
  1.引物长度:15-30bp,常用为20bp左右;
  2.引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性;
  3.避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带;
  4.引物碱基:G+C含量以40%-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC一般随机分布,避免5个以上的嚎吟或e陡核昔酸的成串排列;
  5.引物3’端的碱基,特别是末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败;
  6.引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列一般要有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处;
  7.引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
  引物量:每条引物的浓度0.1-1μmol/L或10-l00pmol/L,以Z 低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
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